原发性肝癌是目前我国常见恶性肿瘤及肿瘤致死病因，主要包括肝细胞癌（HCC）、肝内胆管细胞癌(ICC)和HCC-ICC混合型３种不同病理学类。据世界卫生组织国际癌症研究署发布的全球最新癌症负担数据（LOBOCAN 2020）显示，原发性肝癌发病率居恶性肿瘤第6位，新增90.6万例/年；死亡率居第3位，共计83万例/年，年龄标准化后发病率（ASR）分别为男性14.1/10万、女性5.2/10万，总体死亡率8.7/10万^[1]。据国家癌症中心发布的2015年我国癌症统计数据，原发性肝癌ASR发病率为17.35/10万，ASR死亡率为15.09/10万^[2]；近些年全球原发性肝癌平均年发病率99.5万例，2015年我国新发肝癌37万例，约占全球37.2%^[1]。HCC严重威胁着人类健康，做好HCC的三级预防至关重要。各种血清肿瘤标志物对HCC的筛查具有重要意义，新近研究发展的液体活检技术是诊断技术的重要进步，对HCC的疗效和预后评价、以及早期HCC的筛查具有重要的应用价值。

01

目前临床上HCC生物标记物应用现状

目前临床上常用的HCC血清学标志物有血清甲胎蛋白（AFP）、甲胎蛋白异质体（AFP - L3）和异常凝血酶原（DCP）等多种。

1.AFP：AFP是一种糖蛋白，由591个氨基酸组成，于1956年首次在胎血中被发现，故称甲胎蛋白。健康成年人血清AFP在20 ng/ml以下，临床上AFP升高可见于妊娠、畸胎瘤、肝细胞活动性炎症和HCC等^[3]。AFP诊断各期HCC的灵敏度58.6%~77.5%，特异度80%~97.4%，诊断早期HCC的灵敏度为45.3%~62%，特异度为87%~93%。但随着小肝癌诊断比例不断增加，AFP的灵敏度逐步下降^[1]。2011年美国肝病学会HCC诊疗指南不再将AFP作为HCC的筛查指标^[4]。但在我国AFP依然是HCC早期筛查的重要手段。

2.AFP-L3: AFP-L3是AFP的变异体，不同来源的AFP构型不同。实验发现，AFP与小扁豆素结合后，电泳呈现AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3三个条带。AFP-L3已成为HCC新的诊断标志物，其诊断HCC的特异性高于AFP。研究报道，34.3% AFP正常的HCC患者确诊1年前即可出现AFP-L3异常^[5,6]。荟萃分析研究显示，AFP-L3诊断肝细胞癌的灵敏度和特异性分别为48.3%（45.9%～50.7%）和92.9%（91.6%～94.0%）^[7]。改进后的高敏感性AFP-L3（hs-AFP-L3）检测可以显著提高HCC的诊断敏感性，在AFP＜20 ng/ml时以5%为界限值，hs-AFP-L3诊断HCC的灵敏度为41.5%，特异度为85.1%^[8]。

3.DCP：又称PIVKA Ⅱ ，于1984年首次在HCC患者中发现。国外文献报告，其诊断HCC的灵敏度、特异度和准确度分别为48%～89%、81%～98%和59%～84%，均优于AFP。我国多中心研究提示，DCP鉴别HCC的正确率比AFP高6.2%～20.7%^[9]。国内另有学者研究发现，以81 mAU/ml为阈值，其诊断HCC的灵敏度为84.4%，特异度为88.9%^[10,11]。多数学者认为，DCP与AFP产生的机制不同，两者无相关性，DCP与AFP联用，可进一步提高HCC的早期检出率。

正如上面所述，传统的血清学标志物对HCC的早期筛查和疗效评价具有一定价值，但它的产生和血清浓度受多种因素的影响和干扰，无统一的诊断标准和阈值，诊断的特异度和敏感度都有待于进一步提高，因而临床应用有较大局限性。

02

HCC新型生物标志物的进展

液体活检是一种新发展起来的检验诊断技术。液体活检是相对于组织活检而言，主要检测体液（以血液为主）中的肿瘤相关物质，检测项目主要有游离的循环肿瘤细胞、微小RNA(microRNA）、循环游离DNA（cfDNA）等。液体活检作为最新的检验技术已引起临床的高度关注，但其临床意义及使用价值仍需经临床充分评估与严格验证^[12]。

1.微小RNA(microRNA）检测：microRNA最早于1993年由Lee等人在线虫(G.elegans)体内发现，其由20～25个核苷酸组成，为非编码RNA，在转录后水平调控目的基因的表达。microRNA作为一种新的肿瘤标志物已逐步引起临床重视。microRNA有多种，进行多项目组合检测可提高对HCC的诊断灵敏度和特异度。有研究资料显示，采用由7个microRNA: microR-21，microR-26a，microR-27a，microR-122，microR-192，microR-223和microR-801组成的试剂盒（microRNA7™）对1,812例临床样本进行检测，结果提示，该试剂盒诊断HCC的灵敏度和特异度分别为76.48%和90.03%^[13,14]。

2.cfDNA检测：cfDNA是血液循环中的细胞外DNA片段，长度约为166bp，主要来自机体细胞的主动或被动裂解，携带有机体细胞来源的遗传信息；对癌症患者而言，还包含有源于肿瘤细胞的DNA，称为循环肿瘤DNA（ctDNA）。Tokuhisa等研究发现，丙肝相关HCC患者血清cfDNA含量(115 ± 98.3) ng/ml显著高于单纯丙肝病毒感染者(34.40 ± 40.4) ng/ml。Hosny等研究显示，乙肝相关HCC患者，血清 cfDNA含量显著高于乙肝肝硬化患者和健康人群，分别为(899 ± 2185) ng/ml、（95 ± 238）ng/ml和（45 ± 54）ng/ml^[15]。

cfDNA检测也可用于肝癌预后判断。Tokuhisa等研究发现，丙肝相关HCC患者血清cfDNA浓度越高，总生存期越短，发生转移的风险也越大。Piciocchi等研究显示，以cfDNA 2 ng/μL为阈值，在阈值以下的HCC患者中位生存期（37个月）显著高于在阈值以上的HCC患者（24个月)^[15]。

cfDNA通常携带有机体细胞来源的遗传信息，已有研究发现，肝癌患者的cfDNA携带有较高频率的TP53、TERT启动子、CTNNB1等基因的突变。TP53 R249S突变常见于肝脏疾病患者。国外两位学者Jackson和Gouas分别在肝细胞癌患者中检测到TP53 R249S突变，两份研究报告所提示的突变率分别为40%和46.7%。另有学者研究利用全外显子组测序和多基因靶向测序的方法在HCC患者cfDNA中分别鉴别出822和861个单核苷酸位点变异（SNV），分别占HCC中已知总SNV数的67.4%和83.9%。这些研究均提示，cfDNA基因变异分析对HCC也具有重要的诊断价值^[15]。

03

国内HCC液体活检筛查的大宗研究

2019年3月《美国科学院院刊》（PNAS）发布了由国家癌症中心/中国医学科学院肿瘤医院与北京泛生子基因科技有限公司（以下简称“泛生子”）合作完成的、基于细胞游离DNA（cfDNA）和蛋白标志物在乙肝病毒携带者前瞻性队列中进行肝癌早筛的研究成果^[16]。

该研究应用的是由泛生子自主研发的cfDNA基因突变联合蛋白标志物的液体活检方法。研究纳入4个社区筛查中心，构建的HCCscreen数据分析模型对331例AFP和B超正常的乙肝病毒携带者进行筛查，检出全部4名早期肝癌患者，而检测阴性者在6个月的追踪随访中均未发生肝癌。在扩大样本量的后续研究中，2021年2月完成了对1615名乙肝表面抗原阳性者前瞻队列的随访。数据显示，通过外周血HCCscreen™检测肝癌实现了88%的灵敏度与93%的特异度，显著优于超声检查联合AFP检测取得了71%的灵敏度与95%的特异度。HCCscreen™还实现了40.9%的阳性预测值（PPV）与99.3%的阴性预测值（NPV）。在诊断出的HCC患者中，49%处于早期阶段，肿瘤小于3厘米，而这些患者的预后效果预计会远高于晚期患者。对于小于3厘米的肿瘤，其灵敏度为85%；对于直径3～5cm的肿瘤，其灵敏度为96%。

HCCscreen™的研究亮点是：①规模大：目前中国最大的肝癌社区研究队列，基于中国人群数据，更符合中国人群基因特征；②更严谨：针对癌症高危人群进行研究，排除肝病中也会出现的HCC相关驱动突变干扰，提升检测结果特异性；③更全面：结合cfDNA变异及甲基化、蛋白标志物共同构建模型，评估维度全面，提升检测结果灵敏度；④更客观：前瞻性研究，技术指标基于真实世界数据计算，更客观^[17]。

结语

AFP 、AFP-L3和DCP等血清标志物的检测对HCC的筛查、治疗和预后的评价具有一定临床意义。液体活检（游离循环肿瘤细胞、microRNA、cfDNA等检测）是新发展的医学检验技术，在HCC的早期筛查、辅助诊断、监测疗效和进展以及判断预后等方面均有较好的应用潜能，但其临床意义及使用价值仍需更多的深入研究和实践验证。新一代测序技术的迅速发展为HCC研究提供了一种高通量的检测工具，使HCC研究从单个或多个基因提升到宏基因组的角度，相信cfDNA检测应用前景广阔。